摘要報告了用高效液相色譜法同時測定血清中頭孢哌酮和舒巴坦的含量。本法以外標(biāo)法為基礎(chǔ)，0.5mL血清標(biāo)本經(jīng)甲醇沉淀蛋白，離心后上清液進(jìn)樣。

　　色譜分析條件：以C18反相柱作分析柱，流動相組成為0.005mmol/L四丁基氫氧化銨—乙腈(825∶175，V/V)，磷酸調(diào)整pH至5.0，流速為1.0mL/min，在紫外檢測器230nm進(jìn)行檢測。本法的頭孢哌酮和舒巴坦的*低檢出濃度分別為10mg/L和5mg/L，至少在10～1000mg/L范圍內(nèi)呈線性，頭孢哌酮和舒巴坦的**回收率分別是99.4％～102.9％和95.0％～105.3％，批內(nèi)和批間RSD分別是1.4％、1.5％和1.8％、1.9％。對10種臨床常用的β-內(nèi)酰胺類**進(jìn)行干擾實驗，未發(fā)現(xiàn)有干擾峰。β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生已迅速波及到許多種類的**并且已經(jīng)成為影響β-內(nèi)酰胺類***的主要威脅，以至許多頭孢菌素對產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的**并不具有“深譜”**能力，舒普深(Sulperazon)內(nèi)含舒巴坦鈉和頭孢哌酮鈉；由于舒巴坦(Sulbactam)是一種強(qiáng)有力的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，而頭孢哌酮(Cefoperazone)是第三代頭孢菌素類***，具有廣譜的**作用，兩者聯(lián)合具有明顯的協(xié)同作用，是一種全新的廣譜加上深譜的頭孢菌素類***，在臨床**中廣泛使用。但如果用藥不當(dāng)會產(chǎn)生副作用或未達(dá)到合理用藥的目的。因此，測定血液中該**的濃度，對于研究不同**條件下該**的作用機(jī)理、藥代動力學(xué)以及制定合理的給**案十分必要。用高效液相色譜法測定舒巴坦和頭孢哌酮的方法已有很多報道，但絕大多數(shù)方法是在一個色譜條件下測定一種**，為此，筆者建立了一種能同時測定血清頭孢哌酮和舒巴坦含量的高效液相色譜法。該法在保證足夠的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度的前提下，達(dá)到操作簡便、節(jié)約有機(jī)溶劑、節(jié)省人力和時間的目的。

　　1、測定原理

　　以外標(biāo)法為基礎(chǔ)，血清樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白，取上清液過濾，濾液直接進(jìn)樣，用C18反相柱進(jìn)行色譜分析，紫外檢測器在230nm波長下進(jìn)行檢測，以峰面積定量。

　 2、材料和方法

　　2.1 標(biāo)本的收集和保存抽取血液放入普通玻璃試管中(勿溶血)，分離血清后立即測定，如不能立即測定應(yīng)將血清密封，置4℃冰箱或-20℃下保存，一周內(nèi)測定。

　　2.2 儀器高效液相色譜儀：包括Waters510泵，486紫外可見光檢測器，U6K進(jìn)樣閥，PC800色譜工作站，AST486微機(jī)。平頭微量注射器：Hamilton25μL，美國。樣品過濾器：NewHydePark，日本。樣品過濾膜：Millipore0.5μm，美國。離心沉淀機(jī)：LXJ—Ⅱ型，南京**醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。

　　2.3 試劑標(biāo)準(zhǔn)物：頭孢哌酮(純度為93.8％)和舒巴坦(純度為99.5％)均由中國大連輝瑞制藥有限公司提供。溶劑：四丁基氫氧化銨和磷酸為國產(chǎn)分析純試劑；乙腈和甲醇為國產(chǎn)色譜試劑；水為Millipore超純水器生產(chǎn)。

　　2.4 溶液配制

　　標(biāo)準(zhǔn)液：室溫下分別配制濃度為1g/L的頭孢哌酮和舒巴坦的甲醇溶液，密封。置4℃冰箱保存，用前取出放至室溫后使用。血清標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：參考舒普深血清藥代動力學(xué)資料，確定兩**標(biāo)準(zhǔn)曲線各點的血清**濃度(表1)。用健康正常人無藥混合血清配制。將不同濃度的血清標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液分裝，密封，置-20℃保存，至少在二周內(nèi)是穩(wěn)定的。

　　2.5 樣品預(yù)處理取所需數(shù)目的6mL圓底帶塞試管，于試管中分別加入標(biāo)準(zhǔn)血清應(yīng)用液、空白無藥血清和病人標(biāo)本各0.5mL。于各管中準(zhǔn)確加入甲醇0.5mL，旋渦1min，離心(3000r/min)15min。吸取上清液過濾，取濾液20μL進(jìn)樣。

　　2.6 色譜分析條件分析柱：Nova-PakR○C184μm，3.9mm×150mm，檢測波長：UV230nm，流速：1.0mL/min。柱溫：室溫。

　　2.7 計算在PC800色譜工作站中設(shè)置好各有關(guān)參數(shù)，得出頭孢哌酮和舒巴坦的血清標(biāo)準(zhǔn)物的峰面積。以各藥標(biāo)準(zhǔn)血清的峰面積為縱坐標(biāo)，其相應(yīng)的血藥濃度為橫坐標(biāo)，分別繪制各藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由待測標(biāo)本的峰面積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相應(yīng)的血藥濃度。亦可根據(jù)各藥的峰面積與血藥濃度的回歸方程，計算標(biāo)本的血藥濃度。

　　3、結(jié)果

　　3.1 檢出限以引起兩倍于噪音的藥量為*低檢出量，以經(jīng)預(yù)處理后的進(jìn)樣藥量等于*低檢出量的標(biāo)本**濃度為*低檢出濃度。本法的*低檢出濃度分別是：頭孢哌酮為10mg/L，舒巴坦為5mg/L。

　　3.2 干擾實驗在上述色譜條件下，對10種臨床常用的β-內(nèi)酰胺類**(氨芐青霉素、羥氨芐青霉素、青霉素G鈉鹽、氧哌嗪青霉素、克拉維酸、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢呋辛進(jìn)行了干擾實驗，均未發(fā)現(xiàn)有干擾峰。

　　4、討論

　　4.1 色譜體系的選擇在分析堿性**時，多采用反相柱，它可使血液中的內(nèi)源性強(qiáng)極性成分快速洗脫下來，避免對測定**的干擾，同時也縮短了測定時間，筆者采用了C18反相柱進(jìn)行分離。固定相確定以后，流動相的組分對被測物的色譜分離起著決定性的作用，筆者曾試用甲醇(多種比例)作為流動相中的強(qiáng)溶劑，分離度和峰形均不令人滿意，改用乙腈作為強(qiáng)溶劑和用四丁基氫氧化銨作為添加劑，且按照一定比例配制及調(diào)整pH，就獲得了滿意的分離度。

　　4.2 樣品的預(yù)處理本法樣品處理操作簡單、快速，試劑易得，基本上能滿足臨床檢測的要求，如需提高檢測靈敏度，還需要將提取液進(jìn)一步濃縮和重組，然后再進(jìn)樣分析，此有待進(jìn)一步摸索改進(jìn)。

　　4.3 方法概述和應(yīng)用實例采用本實驗所設(shè)計的流動相能將舒普深中頭孢哌酮和舒巴坦完全分離，雖然舒巴坦中常含有堿性降解物，但它并不干擾本法含量測定；分離后雖然用外標(biāo)法以峰面積計算出組分的含量。但由于樣品處理過程簡單，人為影響因素少，且通過多次實驗證明本法的特異性強(qiáng)，靈敏度較高，重現(xiàn)性和回收率結(jié)果良好，另外，通過比較，無論是用峰面積或是峰高計算結(jié)果，均無明顯差別。本方法建立以后，已對臨床90多人次**病人用藥后的血清標(biāo)本進(jìn)行了測定，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)和**的代謝產(chǎn)物的干擾，說明本法能夠滿足對舒普深臨床血藥濃度和藥代動力學(xué)監(jiān)測的要求。