摘要：脂肪氧化酶(LOX)是一種含非血紅素鐵的蛋白質(zhì)，專一催化具有順、順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸加氧反應(yīng)，氧化生成具有共軛雙鍵的過氧化氫物。它廣泛存在于高等植物體內(nèi)，與植物的生長發(fā)育、植物的衰老、脂質(zhì)過氧化作用和光合作用、傷反應(yīng)及其他脅迫反應(yīng)等有關(guān)。

1引言

小麥胚芽(WG)中的脂肪氧化酶(LOX)能催化氧化WG中的亞油酸，使WG短期內(nèi)酸敗變質(zhì)。為延長保質(zhì)期，常采用加熱處理鈍化LOX。為了*大限度地保護WG營養(yǎng)，加熱溫度和時間的選擇尤為重要。而LOX活性的準確測定則是進行麥胚穩(wěn)定化理論研究的基礎(chǔ)。研究表明，底物溶液的透明度、反應(yīng)緩沖體系pH、反應(yīng)溫度、底物及Tween濃度等因素均會影響測定結(jié)果?，F(xiàn)有的測定方法的酶純化過程繁瑣。此外，不同來源的LOX的*適pH和*適溫度有著較大差異，應(yīng)根據(jù)原料類型進行選擇。為此，建立了一種改良的WG中LOX的檢測方法，簡單快速獲得了透明的底物溶液，省去了粗酶液純化的繁雜步驟。

2實驗部分

2.1儀器與試劑DU800核酸蛋白分析儀(Beckman公司);BR4冷凍離心機(Jouan公司);pHS3B精密酸度計(上海雷磁儀器廠)。小麥胚芽(江南面粉公司);亞油酸標準品(Fluka公司);其它試劑均為分析純。

2.2樣品制備取10g小麥胚芽，粉碎，加入100mL0.1mol/L醋酸鹽緩沖液(pH4.5)，4℃下攪拌30min，懸浮液12000r/min離心30min，獲得酶提取液。用醋酸鹽緩沖液稀釋10倍，作為酶測定液。

2.3底物的配制取111μL亞油酸，無水乙醇定容到10mL，取3.55mL，加入40μLTween20。減壓蒸去乙醇，殘余物溶解在50mL0.05mol/LNa2HPO4溶液中，1mol/LNaOH調(diào)pH至9.0。底物中亞油酸濃度為2.53mmol/L。

2.4酶活的測定檢測波長234nm，溫度25℃;反應(yīng)液：2.0mL緩沖溶液，200μL底物溶液，50μL粗酶液;參比液：2.0mL緩沖溶液，200μL底物溶液，50μL鈍化處理的粗酶液。

3結(jié)果與討論

3.1底物在不同pH條件下的穩(wěn)定性底物溶液分別用pH4.5～9.0的緩沖溶液稀釋10倍，隨著時間的延長，由于亞油酸在酸性條件下溶解度下降，產(chǎn)生渾濁，由于光散射導(dǎo)致吸光度增大。pH值越低，吸光度變化速度越快;pH4.5時達0.19%。而pH8.0和9.0的底物溶液比較穩(wěn)定，吸光度在2h內(nèi)基本保持不變。選擇pH7.0緩沖液稀釋底物，每隔15min測定粗酶液酶活一次。由于亞油酸溶解度的下降，參與催化反應(yīng)的底物量減少，導(dǎo)致同樣的酶液LOX酶活力2h后測定值僅為初始值的69%。為此，本實驗采用亞油酸Tween無水乙醇混合體系配制反應(yīng)底物，使亞油酸完全溶解在Tween中，再通過滴加NaOH，能方便地獲得透明的底物溶液。酶活測定時，在反應(yīng)體系首先加入底物和所需pH值的緩沖液，穩(wěn)定5min，再加入待測酶液，能有效消除在中性和酸性緩沖體系下，亞油酸溶解度下降產(chǎn)生的誤差。

3.2底物濃度的優(yōu)化將不同濃度(0.31～15mmol/L)的底物溶液，用pH7.0緩沖溶液稀釋10倍，進行全波長掃描。隨著底物亞油酸濃度的增加，234nm處吸光度逐漸上升;當?shù)孜餄舛却笥?.0mmol/L時，溶液的吸光度為0.77，如再加入酶液，反應(yīng)體系的吸光度很快上升到2.0，將產(chǎn)生較大誤差。底物濃度小于2.5mmol/L，溶液的初始吸光度則低于0.23。酶活測定時，反應(yīng)體系吸光度3min內(nèi)上升到1.23，符合分光光度分析吸光度在0.1～1.0時線性關(guān)系*佳的要求。當?shù)孜餄舛刃∮?.25×10-4mol/L，由于亞油酸濃度過低，線性關(guān)系差。亞油酸的適合濃度范圍為1.25～2.50mmol/L。

3.3Tween濃度的影響配制3種含不同濃度Tween20的底物溶液(亞油酸濃度均為2.53mmol/L)，測定酶活。結(jié)果表明，Tween20有效增加了亞油酸在緩沖溶液中的溶解度，特別是在pH>8的堿性條件下。然而隨著底物溶液中Tween20濃度增加到0.24%，Tween開始對LOX產(chǎn)生競爭抑制。Tween的合適濃度范圍為0.08%～0.16%。

3.4pH的影響LOX在pH4.5～8.5范圍，均具有較高活力，*適pH為6.5。當pH>9.0時酶活力開始減弱。綜合3.1中pH對底物穩(wěn)定性的影響，*適pH范圍為6.5～7.5。在pH7.0下，RSD=7.2%(n=8)。

3.5溫度的影響在0～45℃,提高溫度能顯著增強LOX的活力;隨著溫度進一步升高，活力開始下降，超過55℃時活力迅速下降，至65℃完全失活。綜合考慮，反應(yīng)溫度選擇25～35℃。在25℃下，RSD=5.3%(n=8)。

3.6方法線性范圍、回收率及精密度粗酶液中蛋白值含量為122.5mg/L。在粗酶液添加量5～70μL范圍內(nèi)對LOX酶活進行分析，得到線性方程ΔA234/min=0.0053V-0.0075(ΔA234/min為每分鐘吸光度的變化;V為加酶量，μL)，r=0.9984。添加20μL粗酶液，添加回收率為88.3%，RSD=6.9%(n=8)。
 

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